Антіпротеіназная біоспеціфіческая Гемосорбція.

Включення в комплексну терапію хворих з важкою інтоксикацією ендогенної на грунті перитоніту гемосорбції на непокритих вугільних сорбентах призводить до зниження сумарної естеразной активності плазми крові. Проте використання даних гемосорбенти не забезпечує достатньої кінетики сорбції протеїназ, а в процесі гемосорбції можуть вилучатись і білки-інгібітори протеолізу. Ці обставини змусили дослідників зосередити зусилля на розробці біоспеціфіческіх антіпротеіназних гемосорбенти.
Пошуки гемосумісність матриці-носія і високоефективного ліганда з широким спектром інгібіторних по відношенню до патогенетично значимим при гнійно-запальних процесах протеиназа призвели до думки про доцільність використання в якості вихідних матеріалів для виготовлення гемосорбенти поліакриламідного гелю і овомукоіда, отриманого з качиних яєць. Дослідженнями, проведеними в Білоруському центрі сорбційних методів детоксикації спільно з Інститутом нафтохімічного синтезу РАН, МДУ ім. Ломоносова і БілНДІ гематології та переливання крові, був створений біоспеціфіческій антіпротеіназний гемосорбенти, що забезпечує ефективну елімінацію з крові активованих серинових протеаз.
Даний гемосорбенти отриманий шляхом іммобілізації в обсязі полімерного гідрогелю білка овомукоіда, виділеного з качиних яєць, який є природним інгібітором серинових протеаз . Гідрогель на основі поліакриламіду не розчиняється у воді, але будучи за природою гідрофільним з'єднанням, сильно набухає. За фізико-хімічної до властивостям дане з'єднання має деяку схожість з живими тканинами: воно еластично, легко проникності для багатьох молекул і містить у своєму обсязі велика кількість води. У процесі перфузії крові через такий гемосорбенти вона взаємодіє з більш "звичної" біосумісною поверхнею. У поліакриламідному гідрогель є пори, які забезпечують ефективний транспорт видобутих субстратів в обсяг полімеру з подальшим їх зв'язуванням овомукоідом. Імболізованний овомукоід виконує роль ліганду, вибірково зв'язує серинові протеази за рахунок утворення з ними міцного комплексу з константою дисоціації порядку 10-10.
Стендові досліди, виконані з метою вивчення можливостей та кінетики сорбції трипсину з водних, показали високу ефективність даного гемосорбенти. У процесі перфузії розчину через масообмінний пристрій з даними гемосорбенти видаляються не тільки трипсин, але і хімотрипсин, плазмін, акрозін, лейкоцитарна еластаза людини, свиняча панкреатична еластаза і ряд інших серинових протеаз. Дослідження. проведені на моделі експериментального панкреатиту, також перший досвід клінічного застосування даного гемосорбенти, показали принципову можливість корекції за допомогою даного гемосорбенти порушень протеїназно-інгібіторної системи.

БІОСПЕЦІФІЧЕСКІЙ АНТІПРОТЕІНАЗНИЙ гемосорбенти "ОВОСОРБ" У ЛІКУВАННІ експериментального перитоніту

Одним з головних компонентів патогенезу розлитого гнійного перитоніту (РГП) є нелімітовані активація всіх ланок ендогенного протеолізу. Пов'язана з цим біодеградація білків організму призводить до важкої білкової дистрофії та накопиченню в рідинних середовищах біологічно активних продуктів кінцевого і проміжного обміну білків. Ця обставина, а також поглиблюється дистрофія органів, в тому числі і системи детоксикації, вносять свій внесок у формування стійкої токсемії.
З метою вивчення можливостей корекції порушень білкового метаболізму за рахунок вилучення з крові надлишку активованих протеїназ шляхом біоспеціфіческой гемосорбції проведено експериментальне дослідження на моделі розлитого гнійного перитоніту у безпородних собак. Маса тварин коливалася в межах від 12 до 33 кг. Всі вони перебували в звичайному раціоні віварію. Розлитої гнійний перитоніт моделювався під морфінної-тіопенталового наркозом шляхом серединної лапаротомії, мобілізації та перев'язки біля основи редуцированного відростка сліпої кишки, інтраопераційного його поранення через всі шари, деоментізаціі. Через 24 години проводилася релапаротомія, видалення відростка і санація черевної порожнини. З цього дня тваринам призначався курс інфузійної терапії (2-кратно, з інтервалом в одну добу), в яку входили сольові розчини (лактосоль, ацесоль, розчин Рінгера) і 10%-ний розчин альбуміну. Співвідношення кристалоїдів до альбуміну було 2:1. Загальний обсяг введеної рідини становив у середньому 20мл/кг маси тіла. Протягом тижня від початку експерименту 2 рази на добу внутрішньом'язово вводився клафоран в дозі 2,0 р.
Всі тварини були розділені на 2 групи: контрольну, в якій здійснювалося наведене вище лікування, і дослідну, де воно доповнювалося 2-кратним , з інтервалом в одну добу, сеансом гемосорбції (ГС) на "Овосорбе" (артеріо-венозний контур, тривалість 1,5 години, швидкість перфузії 15-20 мл/хв, об'єм перфузії 1,0-1,2 ОЦК). В експерименті використовувалися масообмінні пристрої, що складаються зі скляного флакона ємністю 100,0 мл, в який був поміщений гемосорбенти "Овосорб" (60 мл). Для проведення гемоперфузія застосовувалася щілинна перфузионная насадка оригінальної конструкції. Поряд з загальноклінічними показниками вивчалася тріпсіноподобная активність (ТПА) плазми крові, рівень катепсину D, антіпротеіназний потенціал плазми крові по альфа-1-інгібітора протеїназ (альфа-1-ІП) і альфа-2-макроглобуліну (альфа-2-МГ)), розчинні фібрінмономерние комплекси і ранні продукти деградації фібрину (ПДФ).
Розвиток явищ РГП у тварин призводило до виникнення грубих розладів у протеїназно-інгібіторної балансі як контрольної, так і дослідної груп. Вже в першу добу після початку експерименту відмічено різке підвищення ТПА плазми з одночасним достовірним зниженням антіпротеолітіческого потенціалу.

Характер цих змін був в обох групах досить однотипним. ТПА плазми у контрольній та дослідній групах до початку 2-х діб перевищувала вихідні дані відповідно в 3,2 і 3,6 рази, а рівень альфа-1-ІП знижувався відповідно в 1,6 і 1,3 рази.
Істотні порушення протеїназно-інгібіторного балансу приводили до грубих порушень основних показників білкового обміну, що проявлялося, перш за все, різким зниженням рівня загального білка та альбуміну крові.

У плазмі крові накопичувалися надлишкові кількості кінцевих і проміжних продуктів білкового метаболізму Рівень сечовини в плазмі крові збільшувався в 2,6 рази в контрольній і в 1,9 рази в дослідній групах, а рівень СМ - в 2,1 рази в обох групах.
Одночасно з розладами білкового метаболізму у тварин обох груп з'являвся і поступово наростав симптомокомплекс, традиційно описуваний як синдром ендогенної інтоксикації (ЕІ). До кінця першої доби експерименту всі собаки ставали загальмованими, не реагували на заклик і пропоновану їжу. Тварини обох груп втрачали здатність до самостійного пересування, знижувалася больова чутливість. Дихання було частим, поверхневим, пульсація на периферичних судинах слабка, спостерігалися виражена тахікардія, ціаноз і сухість слизових, При аускультації зазначалося відсутність перистальтичних шумів кишечника. Дані зміни свідчили про різке порушення функцій життєво важливих органів і систем.
При релапаротомії на початку 2-х діб в 100% випадків визначалися здуття петель кишечника, фібринозний наліт на парієтальної і вісцеральної очеревини, велика кількість гнійно-геморагічного ексудату з вираженим колібаціллярним запахом.
Розвиток патологічного процесу в контрольній групі тварин супроводжувалося подальшим поглибленням протеїназно-інгібіторного дисбалансу і порушень білкового обміну. Так, ТПА плазми до 3-ї доби експерименту наростала і перевищувала вихідні значення в 5 разів (рис.1), в той же час інгібіторний потенціал крові продовжував знижуватися: рівень альфа-1-ІП до цього часу становив 42,4% від вихідних значень (рис.2). різке зростання протеолітичної потенціалу крові, що свідчить про генералізацію ендогенного протеолізу, призводило до достовірного зниження рівня загального білка та альбуміну в 1,2 і 1,3 рази від вихідних значень відповідно.
Незважаючи на проведене медикаментозне лікування, в усіх тварин контрольної групи явища ендотоксикозу продовжували неухильно поглиблюватися.


При явищах грубих розладів життєво важливих функцій протягом 36-72 годин від початку експерименту констатована смерть усіх тварин контрольної групи. Середня тривалість життя експериментальних тварин цієї групи склала 49,0 +9,0 годин від початку експерименту. На аутопсії в черевній порожнині - ознаки фібринозно-гнійного запалення, збільшена повнокровна печінку, численні субсерозні петехіальні крововиливу у всіх відділах тонкої кишки, склеювання фібрином окремих її петель.
Інша картина динаміки патологічного процесу спостерігалася у дослідній групі тварин. Одноразовий сеанс ГС на "Овосорбе" призводив до істотного зниження ТПА плазми крові, хоча в постсорбціонном періоді вона ще перевищувала вихідний рівень у 2 рази. Повторна ГС усувала відхилення даного показника від нормальної величини на весь наступний період спостережень (рис.1) На відміну від контрольної групи, де інгібіторний потенціал крові знижувався, незважаючи на проведене медикаментозне лікування, в дослідній серії тварин зазначено поступове наростання альфа-1-ІП. Так, на 3-ю добу, після 2-ї ГС рівень його був знижений тільки на 11,6% в порівнянні з вихідним значенням, а до кінця спостереження на 7% перевищував такі
Незважаючи на включення ГС на "Овосорбе" в лікування собак дослідної групи, рівень загального білка в плазмі крові безпосередньо після 1-ї та 2-ї ГС продовжував падати і до кінця 3-х діб був знижений в 1,2 рази. Однак до 7-ї доби спостереження за тваринами кількість загального білка зросла на 11,9% в порівнянні з його концентрацією на 3-ю добу експерименту. Виявлена ??тенденція зберігалася і до 20-ї доби спостереження. До цього часу даний показник достовірно не відрізнявся від вихідних значень. Рівень альбуміну в процесі лікування із застосуванням ГС на "Овосорбе" практично не змінювався. У контрольній групі до 3-ї доби спостерігалося зниження альбуміну на 25,6%.
Проведення ГС на антіпротеіназном гемосорбенти "Овосорб" у дослідній групі тварин сприяло суттєвому зменшенню утворення і накопичення в організмі проміжних і кінцевих продуктів метаболізму білка. Вже після першої ГС рівень СМ в плазмі знижувався на 20,6%, а сечовини - на 16,9% в порівнянні з досорбціоннимі значеннями. Після другої ГС рівень СМ знижувався на 45,6%, а концентрація сечовини в крові нормалізувалася. До 7-м доби від початку експерименту відзначена нормалізація і рівня СМ плазми крові.
Поліпшення показників білкового обміну у тварин дослідної групи супроводжувалося зменшенням вираженості явищ ЕІ. При цьому позитивні зрушення починали виявлятися вже після першої і, особливо, після другої гемоперфузія. До 3-4 діб від початку експерименту у собак зникали ознаки загальмованості, з'являлася жива реакція на навколишнє. Вони реагували на заклик і пропоновану їжу, ставали більш активними і рухливими. Із 17 тварин цієї групи вижило 15.
Таким чином, проведення ГС на антіпротеіназном гемосорбенти "Овосорб" забезпечує ефективну корекцію порушеного протеїназно-інгібіторного балансу, що призводить до нормалізації білкового метаболізму і купіруванню важких розладів функції життєво важливих органів і систем. Зниження ендогенної інтоксикації та пов'язаних з нею функціонально-метаболічних порушень після елімінації з крові частини серинових протеїназ підтверджує концепцію про ключову роль гіперактивності протеолізу в молекулярних механізмах синдрому ЕІ при перитоніті. Отримані в експерименті дані свідчать про те, що біоспеціфіческая гемосорбція на афінному антіпротеіназном сорбенті є патогенетичним засобом корекції гомеостазу при РГП.

ЗАСТОСУВАННЯ БІОСПЕЦІФІЧЕСКОГО АНТІПРОТЕІНАЗНОГО гемосорбенти "ОВОСОРБ" У комплесних ЛІКУВАННІ ХВОРИХ З розлитого гнійного перитоніту.

Вивчено характер лікувальної дії і стан деяких ланок білкового метаболізму у зв'язку із застосуванням гемосорбції на біоспеціфіческом антіпротеіназном гемосорбенти "Овосорб" в комплексному лікуванні 104 хворих з розлитим гнійним перитонітом апендикулярного генезу. Гемосорбція проводилася із застосуванням скляних флаконів і насадок перфузійних щілинних.
Стан хворих цієї групи перед включенням ГС в комплексну терапію суттєво не відрізнялося від такого в інших групах з даною патологією та оцінювався як тяжкий або вкрай тяжкий. У всіх хворих були суттєві порушення свідомості аж до делірію. При цьому відзначені порушення дихання у вигляді задишки змішаного типу, виражена тахікардія, нестабільність АТ з тенденцією до гіпотонії, а також парез кишечника, що проявляється картиною динамічного ілеусу. У всіх хворих відзначалося зниження екскреторної функції нирок. В гемограмі реєструвався лейкоцитоз, прискорене ШОЕ. Рівень гемоглобіну був у межах норми. У ряду хворих виявлялася токсична зернистість нейрофілів.

ЗМІНИ біохімічних показників плазми крові У ГРУПІ ХВОРИХ З РГП Аппендікулярний ГЕНЕЗУ У ПРОЦЕСІ КОМПЛЕКСНОЇ ТЕРАПІЇ З ВИКОРИСТАННЯМ Гемосорбція НА БІОСПЕЦІФІЧЕСКОМ АНТІПРОТЕІНАЗНОМ гемосорбенти "ОВОСОРБ"

Показник Од. до ГС після ГС через добу після ГС
Загальний білок г/л 55,4 +2,2 54,4 +2,2 55,2 +2,0
Альбумін г/л 25,1 + 1,1 25,8 +1,3 23,8 +1,4
Фібриноген г/л 4,8 +0,8 4,7 +0,9 4,6 +0,7
Тріпсіноподобная активність (ТПА) нмоль/(СХЛ) 28,3 +9,4 14,5 +2,9 * 28,7 +16,1 *
Катепсин D (ФЕ) 153,6 +17,2 131 , 8 +19,5 115,0 +12,1
плазміноген мм2 185,9 +13,5 190,0 +16,0 194,0 +14,0
прекаллікреін МО/мл 200, 0 +18,3 175,7 +17,8 * 232,8 +30,0 *
Калікреїн МО/мл 2,3 +1.1 7,2 +2,9 * 0 *
Альфа- 1-інгібітор протеїназ (альфа-1-ІП) 14,9 +0,1 15,1 +0,8 14,2 +2,1
Альфа-2-макроглобулін (альфа-2-МГ) мкмоль/(СХЛ) 0,33 +0,04 0,34 +0,08 0,35 +0,06
Продукти деградації фібрину мкг/мл 155,0 +3,0 130,0 +1,0 * 112 , 0 +2,0 *
Середні молекули (СМ) г/л 1,7 +0,15 1,79 +0,07 1,28 +0,06 *
Сечовина мкмоль/л 8 , 58 +0,94 9,28 +1,04 7,9 +0,9

Примітка: * - позначені достовірні відмінності показників.

Безпосередньо після сеансу ГС на "Овосорбе" відзначено достовірне зниження протеаземіі, при цьому ТПА плазми знижувалося в 2 рази. Через добу після ГС рівень ТПА плазми знову повертався до досорбціонним значень. При цьому вміст інгібіторів протеїназ достовірно не змінювалося.
Дослідження активності катепсину D в плазмі крові хворих показало, що рівень його достовірно не змінювався до кінця першої ГС, але через добу достовірно знижувався в порівнянні з досорбціонним рівнем. Зниження вмісту катепсину D - кислому лізосомальної пептид-гідролази, не інгібіруемой овомукоідом, свідчить про зменшення активації системи тканинного протеолізу в результаті елімінації "Овосорбом" плазмових серинових протеїназ.

У результаті гемоперфузія. на "Овосорбе" у хворих відбувалися зміни і в калікреїн-кінінової системи. Про це свідчило збільшення в 3,1 рази "вільної" каллікреіновой активності плазми і достовірне зниження вмісту прекаллікреін.
Слід зазначити, що через добу після сеансу ГС на "Овосорбе" "вільна" активність калікреїну різко зменшувалася порівняно з такою відразу після ГС, а зміст його попередника (прекаллікреін) зростала. Цілком очевидно, що подібна реакція каллікреінкініновой системи була обумовлена ??її активацією при контакті з металевими і скляними деталями масообмінного пристрою. При цьому необхідно нагадати, що на відміну від інших серинових протеїназ, калікреїн не інгібує овомукоідом.
З даних таблиці 1 видно, як безпосередньо після ГС, так і через добу після її проведення кількість плазміногену в плазмі крові не змінювалося. Разом з тим кількість продуктів деградації фібрину, маркерів активності тромбиновой і плазмінової систем, як відразу після ГС на "Овосорбе", так і через добу вірогідно зменшувався. Зміст альфа-1-ІП та альфа-2-МГ в плазмі залишалося незмінним як безпосередньо після ГС, так і через добу після неї.
Необхідно також відзначити, що сеанс ГС з використанням даного типу сорбенту не чинив достовірного на концентрацію загального білка, альбуміну, сечовини і РМ. Однак через добу після ГС відзначено зниження концентрації сечовини. Не відбувалось подальшого наростання рівня СМ. До моменту завершення допоміжної сорбційної терапії уровеньТПА плазми знижувався до норми. У цьому періоді відновлювався і інгібіторний потенціал крові. Відзначено також і поступова нормалізація рівня СМ, сечовини, концентрації загального білка та альбуміну крові.