Конструювання ліків для лікування хвороби Паркінсона.

Атланта-96. Олімпійський факел в руках Мохаммеда Алі. Хто дивився репортаж, зауважив, що видатний боксер страждає хворобою Паркінсона. Телеглядачі могли спостерігати всі основні симптоми цього захворювання: ригідність, тремор, гіпокінезія. У перекладі на російську це означає: зайвий тонус у м'язах, тремтіння окремих частин тіла і мала рухливість, яка згодом може призвести до акинезии - повної нерухомості.
Паркінсонізм - досить поширене (100 хворих на 100 тис. населення) хронічне захворювання серед людей похилого віку. У 60-х роках було виявлено, що при хворобі Паркінсона в стріатумі (одному з підкоркових відділів мозку, що бере участь у координації рухової активності та формуванні емоційної реакції) знижений зміст нейромедіатора дофаміна. Виникає це захворювання внаслідок порушень функцій чорного тіла (структури середнього мозку), причиною яких можуть стати і вірусна інфекція, і пухлину, і механічні пошкодження нейронів чорного тіла, і поразки їх токсичними речовинами. Останнім часом серед хворих паркінсонізмом все більше молодих людей. Очевидно, це пов'язано з поширенням наркотику (крека), в якому присутній токсична для нейронів чорного тіла домішка. Крім того, в навколишньому середовищі напевно, є і інші подібні, але поки ще не ідентифіковані, токсини.
Бар'єри, бар'єри, кругом одні бар'єри
Отже, в нейронах чорного тіла виробляється дофамін, який потім виділяється в синаптичну щілину (простір між мембранами контактують нервових клітин, де відбувається передача імпульсів), і цей сигнал приймається нейронами стріатума. Отже, можна припустити, що, компенсувавши недолік дофаміну в цьому відділі мозку, можна зняти симптоми захворювання. Такий метод лікування називають замісною терапією, а самим ефективним способом доставки дофаміну могла б бути ін'єкція його розчину безпосередньо в стріатум, але це - дуже ризиковано і небезпечно для пацієнта.
Спробували вводити дофамін всередину. Ніякого ефекту! У чому ж справа? Виявилося, що при такому введенні дофамін з'являється в крові та тканинах практично у всіх органах, але тільки не в мозку. Чому?
У шлунково-кишковому тракті всмоктуються тільки ті речовини, які здатні подолати мембрану епітеліальних клітин (ентероцитів) за допомогою специфічних переносників. Також можуть проходити гідрофобні речовини, оскільки вони розчиняються у ліпідної мембрані клітин. Потім "щасливчики" виявляються в капілярах, і на їх шляху виникає новий бар'єр - печінка, де знаходяться ферменти, що руйнують чужорідні для організму сполуки (ксенобіотики). У крові теж присутні ферменти, які можуть руйнувати ліки. Вже на цьому етапі, в кровотоці виявляється часом менше 50% препарату, а адже попереду ще одне дуже серйозна перешкода - гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) - бар'єр між кров'ю і мозком, по-англійськи це виглядає майже містично: blood-brain barrier (bbb) . Але цей бар'єр має цілком фізичну природу. Капіляри мозку на відміну від усіх інших капілярів не мають ніяких пор. Клітини епітелію в них щільно прилягають один до одного, і між ними ніщо не просочиться. Взагалі-то капіляри існують для того, щоб постачати органи і тканини живильними речовинами, для цього-то їм всім і потрібні пори. Усім, крім капілярів мозку. Мозок як центральний орган охороняється особливо ретельно від проникнення більшості сполук. У тих же поживних речовин, які повинні потрапити в мозок (амінокислоти, пурину, глюкоза тощо), є спеціальні переносники через мембрани епітеліальних клітин капілярів. Всі інші, які не можуть бути впізнаними білками-переносниками (як, наприклад, дофамін), в мозок проникнути не можуть.
Але багато хто на власному досвіді знають, що є речовини, які не відносяться до поживним, але після прийому всередину досить швидко опиняються в мозку. Всі, хто випив хоча б чарку вина, відчув дію спирту на мозок. Є й інші сполуки, які потрапляють в мозок, не маючи спеціальних переносників: наркотики, заспокійливі препарати, релаксанти, транквілізатори. Як їм це вдається? Проходять не в двері, де перевіряють за списком, а крізь охороняється паркан. Справа в тому, що всі перераховані речовини - амфіфільні, в їх структурі представлені як полярні, так і гідрофобні групи. Тому вони пристойно розчинні не лише у воді, але і в гідрофобною мембрані клітин. Дофамін - занадто полярне з'єднання (відмінно розчиняється у воді, але дуже погано в ліпідної мембрані), тому "крізь стіну" епітелію капілярів мозку йому не пройти.
Схема проходження ДОФА (биосинтетического попередника дофаміну) через щільний шар епітеліальних клітин капілярів головного мозку і його перетворення в активний дофамін (виділено кольоровими стрілками). ДОФА використовує переносника тирозину (виділено кольором), а дофамін і дігідроксібензіламін цей переносник не дізнається, бо їм крізь мембрану не пройти
Ліки в маскхалаті
На щастя, у дофаміну є біосинтетичних попередник - дигідроксифенілаланін (ДОФА), що може проникнути крізь гематоенцефалічний бар'єр за допомогою переносника тирозину - амінокислоти, що відрізняється від ДОФА лише однієї гідроксильної групою. Потрапивши в мозок, ДОФА піддається декарбоксилюванню і перетворюється на дофамін. Такий прийом, коли для поліпшення біодоступності або інших фармакокінетичних параметрів лікарської речовини на нього "надягають" маскуючі фрагменти, відомий досить давно, а попередник, що перетворюється в організмі в активне з'єднання, називається проліками.
У наші дні ДОФА - основний, але далеко не ідеальний препарат для лікування хвороби Паркінсона. Він проникає в мозок, але в інші органи проходить не гірше, тому, щоб створити потрібну концентрацію в капілярах мозку, потрібні кінські дози. Ось витяги з знаменитого довідника М.Д. Машковского: "Початкова доза 0.25 г на день, яку при необхідності збільшують до 4-5 г, а при гарній переносимості добова доза досягає 6 м. При розвитку побічних явищ зменшують дозу або припиняють прийом препарату". А побічні явища - це "диспепсія, ортостатична гіпотонія, аритмії, гіперкінези, головний біль, гіпергідроз та ін".
Більшість перерахованих явищ пов'язане з передчасним декарбоксилювання ДОФА в дофамін в периферичних тканинах, куди він може забрідати по дорозі в мозок, що, природно, призводить і до зниження (до 80%) концентрації ДОФА в крові. У деяких органах (в серці, в нирках) є дофамінові рецептори, і тому що утворюється в результаті біотрансформації дофамін викликає побічні ефекти в цих органах. Для ослаблення периферичного декарбоксилювання застосовують суміш ДОФА з інгібіторами ферментів, що руйнують ДОФА, але і це дає незначний ефект.
"Хто нам заважав, той нам і допоможе!"
Є дуже елегантний спосіб збільшити селективність ліки по відношенню до мозку. Цей спосіб нагадує ситуацію у фільмі "Кавказька полонянка". Там, якщо ви пам'ятаєте, прозвучала фраза: "Хто нам заважав, той нам і допоможе!" Справа в тому, що ГЕБ НЕ проникний для полярних речовин в обох напрямках. Якщо створити гідрофобна проліки, яке, проникаючи в тканини, ставало б полярним, його селективність у цьому випадку підвищилася за рахунок того, що воно не змогло б уже вийти з мозку, тоді як в інших тканинах, де є пори, таке перетворення не заважає зворотному виходу. Таким чином, активна речовина накопичувалося б в мозку.
Розробив цей методичний прийом дуже плідний ідеями американський хімік Н. Бодор, що запропонував з'єднати молекули ліки з похідними нікотинової кислоти, які легко окислюються під дією ферментів (Bodor N. Pharmaceutical formulations for parenteral use containing cyclodextrins and dihydropyridine redox systems (Eur. Pat. № 335 545. 1989 .)). Про-проліки (DN) отримують у відновленому вигляді і вводять в організм; в тканинах воно окислюється до зарядженого і тому нерозчинного в мембрані проліки (DN +), потім в мозку амидная зв'язок гідролізується, і утворюється дофамін (D).
Селективність розподілу здатних до окислення похідних нікотинової кислоти. Гідрофобна про-проліки - кон'югат дофаміну і N-метілнікотіновой кислоти (DN) - легко проходить через стінки капілярів, потрапляє в тканини, там окислюється, утворюючи заряджене проліки (DN +), і стає нерозчинним в мембрані клітин.


Назад він може вийти, тільки якщо в капілярах є пори, в капілярах ж мозку їх немає, тому окислений кон'югат там затримується.

Гідрокостюм для ліків, які не люблять воду
Гідрофобні з'єднання, природно, погано розчиняються у воді (загальне правило: чим краще речовина розчиняється в мембрані клітин, тим гірше - у воді). З цим пов'язані труднощі, які виникають при створенні в кровотоці потрібних концентрацій гідрофобних ліків. Для підвищення біодоступності треба підібрати відповідний переносник. Як природа вирішила цю проблему? Адже існують гідрофобні, не розчинні у воді вітаміни (А, Д, Е), гормони (тироксин, статеві гормони), ліпіди (холестерин, жири), які потрібно переносити від місця синтезу до всіх клітин. Для кожного з таких речовин існують білки-переносники, а для холестерину - контейнери: ліпопротеїни, що складаються з багатьох тисяч молекул. Вони добре розчиняються у воді, так як на їх поверхні експоновані полярні амінокислоти, і мають "кишені", вистелені гідрофобними амінокислотами. Хіміки для цих цілей запропонували циклодекстрини, у яких поверхня гідрофільна, а порожнина гідрофобна. Саме в цю порожнину можуть включатися гідрофобні сполуки відповідного розміру.
Переносники гідрофобних речовин: білок-переносник жиророзчинних вітамінів (еліпс ліворуч) і штучний переносник - циклодекстрин. Білок добре розчиняється у воді, оскільки його поверхня складається з полярних амінокислот. У його "кишеню", вистелений гідрофобними амінокислотами, поміщаються переносяться речовини (зображений вітамін А). Циклодекстрин - водорозчинний олігосахарид, в його канал можуть входити гідрофобні речовини відповідного розміру (показаний DN).
Батискаф для будь-яких ліків
Ліпосоми (фосфоліпідних бульбашки) давно досліджуються як перспективна лікарська форма, істотним чином змінює розподіл лікарської речовини і захищає його від впливу ферментів; нагоді вони й нам. Ці мікросфери (розміром від 25 нм до 1 мкм) служать контейнерами для лікарських речовин, причому полярні з'єднання розміщуються у внутрішньому водному обсязі ліпосом, а гідрофобні - добре розчиняються в мембрані. Ми зайнялися розробкою ліпосомних форми ДОФА, сподіваючись, що вони будуть мати певні переваги перед розчином. По-перше, мембрана ліпосом обереже ДОФА від передчасного декарбоксилювання і не допустить падіння концентрації активної речовини в крові. Таким чином, відпаде необхідність у використанні кінських доз препарату. По-друге, так як пори капілярів менше діаметра ліпосом, вони не зможуть покинути кровотік, а, отже, ДОФА не потрапить в периферичні тканини і не матиме побічних явищ.
Схема ліпосоми - переносника лікарських речовин, мембрана якої вистелена природними фосфоліпідами. У внутрішньому водному обсязі розташовуються водорозчинні речовини (наприклад, ДОФА або дофамін), в ліпідної мембрані ліпосоми може переносити гідрофобні речовини.
Треба було перевірити наші припущення в експерименті. Ліпосоми отримують в розчині активної речовини, при цьому всередину ліпосом потрапляє лише 8-10% ДОФА, все інше видаляється за допомогою діалізу або гельфільтраціі (вид хроматографії, що дозволяє розділяти речовини за розміром). Ліпосоми вводили мишам з синдромом Паркінсона, який розвивався в них під дією 1-метил-4-феніл-1 ,2,3,6-тетрагідропірідіна (МРТР) - ще одного гідрофобного аналога дофаміну. МРТР добре проникає в мозок, де окислюється до четвертинної солі, але не може вийти звідти (як згаданий окислений кон'югат дофаміну і нікотинової кислоти) і пошкоджує клітини, що виробляють дофамін.
Про формування синдрому Паркінсона судили за зниження рухової активності у випробовуваних. Після введення ліпосомних препарату ДОФА спостерігали за їх станом і порівнювали з поведінкою контрольних мишей. Повний експеримент займав майже місяць.
У результаті з'ясувалося, що ліпосомних препарат у дозі, що в 10 разів меншою, ніж розчин ДОФА, давав більше виражений антипаркінсонічний ефект. Таким чином, наші надії повністю виправдалися. Крім того, дія ліпосомних препарату триває майже в три рази довше, ніж розчину ДОФА. Але найдивніше виявилося, коли випробували ліпосоми, навантажені дофамином: вони надавали майже те ж дію, тоді як розчин дофаміну (який, як уже зазначалося, практично не проникає через ГЕБ) ніякого ефекту не давав! Пояснити цей факт можна тим, що ліпосоми безпосередньо сприяють "протягуванню" свого вмісту через гематоенцефалічний бар'єр, але прямо підтвердити краще проникнення біогенних амінів, завантажених в ліпосоми, виявилося складним. У наших експериментах ми визначали в мозку концентрацію вводяться речовин та їх метаболітів, але зрозуміти, яка частина дофаміну утворюється з введеного препарату, а яка синтезувалися мозком, без використання мічених сполук було неможливо.
Порівняння рухової активності мишей різних груп. Дія ліпосомних препарату ДОФА на мишей з синдромом Паркінсона (виділено кольором) викликало більш виражений антипаркінсонічний ефект у порівнянні з розчином цього препарату (другий стовпчик ліворуч). Контролем служили хворі і здорові тварини, яким вводили тільки фізрозчин (третій і четвертий стовпчики відповідно).
Не маючи гербової, пишемо на простому
Так як експерименти з міченими сполуками дуже дорогі (і не нешкідливі), ми провели досвід з ліпосомних формою не природного аналога дофаміну - дігідроксібензіламіна. У мозку це з'єднання не синтезується і крізь гематоенцефалічний бар'єр самостійно проходить погано, тому подолати гематоенцефалічний бар'єр і опинитися в мозку у великих кількостях він може тільки завдяки ліпосоми. За допомогою цього експерименту вдалося підрахувати, що концентрація дігідроксібензіламіна в стріатумі мишей при використанні ліпосом у 100 разів більше, ніж у разі введення розчину.
Знаючи масу миші та обсяг її крові, легко прикинути максимальне відміну концентрацій активної речовини (дігідроксібензіламіна або ДОФА, або дофаміну) у крові при введенні двох різних лікарських форм: ліпосомних препарату і розчину. Навіть якщо допустити, що ліки з розчину рівномірно розподілилася по всіх тканинах організму тварини, а укладену в ліпосоми речовина не покидає кровотоку і зовсім не руйнується (ні того, ні іншого насправді в повній мірі не буває), то і в цьому випадку концентрація ліпосомних препарату не може перевищити концентрацію ліків, введеного у вигляді розчину, більш ніж у 50 разів.
Пояснити таку велику різницю (у 100 разів на стріатумі і в 50 - в крові) поки важко, але у нас є деякі припущення, які ще належить перевірити. Ситуація цілком звичайна - довгий час був невідомий механізм дії аспірину, що не заважало його успішно використовувати.
Активно накачуємо ліпосоми ліками
Крім очевидних переваг використання ліпосом існує великий недолік. Нагадаємо, що при стандартному способі завантаження ліпосом активної речовини в них з розчину надходить небагато. Тому для досягнення необхідного ефекту доводиться вводити велику кількість ліпосом, разом з якими в організм потрапляє не тільки ліки, але і фосфоліпіди ліпосом. Хоча фосфоліпіди - звичайні речовини в людському організмі (з них складаються мембрани всіх клітин), тим не менш занадто великі їх кількості можуть порушити роботу печінки.
Для збільшення питомої завантаження ми використовували прийом, званий активної завантаженням. Він заснований на значну різницю в проникності ліпідної мембрани для нейтральних та заряджених (протоновані) форм молекул дофаміну. У розчині дофаміну переважають заряджені форми, але завжди присутня і деяка кількість нейтральних. Незаряджені молекули більш гідрофобні і, як ми вже неодноразово згадували, краще розчинні в ліпідної мембрані клітин і ліпосом. Якщо в суспензії "порожніх", нічим не завантажених ліпосом розчинити дофамін, то дифузія нейтральної частини популяції його молекул через мембрану призводить до поступового переходу дофаміну усередину ліпосом.