Місце якісної модифікації методу ПЛР в первинній діагностиці ІПСШ і контролі ефективності лікування.

У чималому ступені успіху полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) сприяла поява на медичному ринку високотехнологічних комерційних тест-систем, значно спростити і прискорити проведення реакції. У той же час застосування нового методу поставило і ряд питань, одне з яких - інтерпретація результатів ПЛР. Висока чутливість методу має й зворотний бік - виявляються десятки і сотні копій мікроорганізмів у пробі не завжди "достатні" для виникнення захворювання. Позитивні результати ПЛР у відсутність клінічних ознак захворювання (нерідко супроводжуються негативними результатами інших лабораторних досліджень) дозволило "пред'явити звинувачення" цього методу в гіпердіагностики. Відкритим залишається питання про трактування результатів контрольних досліджень методом ПЛР: якісний метод не дозволяє достовірно оцінити динаміку популяції збудника під впливом проведеного лікування.
Тест-системи, що створюються для кількісного визначення патогенів методом ПЛР, або володіють меншою чутливістю в порівнянні з "якісними" (більшість наборів із внутрішнім контролем), або вимагають значно більших витрат витратних матеріалів (метод послідовного розведення). Крім того, в умовах використання реального клінічного матеріалу нерідко спостерігаються парадоксальні ситуації, коли зразки з великим вмістом визначається ДНК дають більш слабке світіння, ніж проби, бідні "мішенями", і навпаки.
Метою даної роботи була оцінка ефективності якісного визначення збудників інфекцій, що передаються статевим шляхом (ІПСШ) на підставі зіставлення частоти їх виявлення до проведення лікування і після закінчення терапії.
Матеріали і методи. Матеріал (сеча, зіскрібки з цервікального каналу, уретри, епітелій з заднього склепіння піхви, аспірату з порожнини матки) отримували від жінок, які зверталися за допомогою до лікарів-гінекологів жіночих консультацій м. Хабаровська. Всього було обстежено 2112 осіб, 1747 з них - при первинному відвідуванні лікаря і 365 - після проведення лікування. Кількість аналізів склало відповідно 6728, 6179 і 549. Контрольне дослідження здійснювали не раніше, ніж через 14 днів (для хламідій - не раніше одного місяця) після закінчення терапії. Для проведення ПЛР використовувалися російські діагностичні тест-системи ("гарячий старт") за технологією, рекомендованою виробником наборів. Результати детекції документувалися фотографуванням гелю на фотоплівку "Мікрат-300". За рахунок високого коефіцієнта контрастності (? = 4,0) та тривалої експозиції фіксувалися смуги ампліфіката, недоступні для візуального розрізнення. Дані зберігалися і оброблялись в СУБД MS Access 97.
Результати та обговорення. Проведене дослідження показало, що Chlamidia trachomatis і Mycoplasma hominis були присутні відповідно в 20,5 і 31,8% досліджених зразків (див. Таблицю 1). Частота виявлення цих мікроорганізмів істотно не відрізнялася під час першого відвідування лікаря і при контрольному обстеженні після лікування. Який парадокс можна легко пояснити: терапія була призначена тим жінкам, у яких було виявлено збудник захворювання, інакше кажучи, - інфікованість в цій групі спочатку складала 100% а після проведення лікування знизилася для мікоплазм втричі й уп'ятеро для хламідій.
M.genitalium в пробах, узятих до початку терапії, зустрічалася в 9,3% (у контролі після лікування - 6,4%), U.urealiticum - 62,8% (53%). Персистенція цитомегаловірусу в цервікальному каналі встановлена ??в 21,1% (проведене лікування знизило цей відсоток до 13,3), вірус простого герпесу виявлено у 18,3% (9,1%).
Наведені результати з певними застереженнями дозволяють оцінити стійкість різних груп мікроорганізмів до терапії (зокрема, враховуючи того, що великий обсяг вибірки за різними медичним установам нівелював особливості схем лікування). Так, практично при однаковій частоті виявлення трихомонад і кандид до початку терапії (близько 23%), перші згодом ідентифіковані тільки у 14,3%, а другі виявлені у 40% лікувалися жінок. Отримані дані добре вписуються в спостережувану нами останнім часом картину: трихомоніаз та гонорея, на відміну від інших ЗПСШ, стали зустрічатися рідше (це ж показує і Російська статистика). У той же час, рецидивуючі кандидози і бактеріальні вагінози (БВ) стали настільки звичним явищем (наприклад, останні ми діагносціруем у 26% жінок), що деякі лікарі стали вважати їх варіантом норми. Що ж показує проведене дослідження? Gardnerella vaginalis не тільки частіше інших виявляє себе у генітальному тракті жінок, але і ділить пальму першості по стійкості до проведеної терапії (50%) з U.urealiticum (53%) - другим, чи не облігатним компонентом біоценозу піхви при БВ. Про третій компоненті - Mycoplasma hominis-було сказано вище.
Розуміючи безумовну неприйнятність напівкількісної оцінки ПЛР в кожному окремо взятому дослідженні, ми зробили спробу використовувати даний метод для порівняльної оцінки щодо великих груп (жінок до початку лікування і після його завершення). У цьому разі девіації, пов'язані з наявністю інгібіторів термостабільної полімерази і т.п.


взаємно гасяться в обох досліджуваних групах, оскільки починають "працювати" закони статистики для великих популяцій.
Інтенсивність світіння смуги продукту ампліфікації зіставляли з люминисценции ампліфікованої фрагмента відповідної контрольної ДНК (4 бали, або 4 +). Невидимою оком, фіксованого тільки на фотоплівці світиться смузі ампліфіката відповідав 1 +. Решта градації займали проміжне становище.
Результати такого "напівкількісного" дослідження наведені в Таблиці. Найбільш цікавим нам представляється оцінка інтенсивності реакції групи хламідій. Якщо при первинному дослідженні смуги продукту ампліфікації світилися досить яскраво (в усі "бальні" інтервали потрапило приблизно однакове число проб), то в контрольному тесті явно переважали вкрай слабкі (невидимі оком, але абсолютно чітко зафіксовані на фотоплівці) сигнали. "Видимі" смуги склали в контролі менше третини від усіх виявлених!
Як вказувалося, контрольне дослідження на хламідії проводили через місяць і більше після завершення терапії, коли відбувалося повне заміщення клітин призматичного епітелію і елімінація що знаходяться в них загиблих ретикулярних та елементарних частинок хламідій . Проведені контрольні дослідження не показали наявності смуг в "негативних контролях". Тому наведені вище результати не можуть бути наслідком технологічних похибок.
Мабуть, наведені факти мають спонукати зробити відповідні висновки дослідників, які ігнорують застосування фотографічних або електронних (чутлива відеокамера? Комп'ютер) технологій фіксації результатів ампліфікації.
При трактуванні результатів ПЛР лікар повинен враховувати сучасний стан питання: хламідійна інфекція підступна. Цей вид мікроорганізмів являє собою реальну загрозу для жінки і дитини навіть у мінімальних кількостях, що виявляються молекулярно-біологічними методами.
Не існує чітких критеріїв ступеня небезпеки присутності різної кількості CMV і HSV в цервікальному каналі, але достовірно відомо, що сам факт їх персистенції визначає значно більш високий відсоток інфікування дитини під час пологів навіть у серопозитивних, що володіють певним імунітетом, жінок. При первинному інфікуванні частота і тяжкість вірусних уражень на багато разів.
Дещо складніше трактування виявлення мікоплазм. Відомо, що, наприклад, уреаплазми можуть тривалий час персистувати в урогенітальному тракті, не викликаючи видимих ??патологічних змін. Високий відсоток виявлення даного виду мікроорганізмів в наших дослідженнях також побічно свідчить про відсутність 100% патогенності. Враховуючи побічні дії антибіотиків, при відсутності клінічних проявів виявлення уреаплазм не повинно служити показанням до антибіотикотерапії (виняток - планована вагітність - див. нижче), може бути рекомендована корекція імунітету. Тим не менш, при запальному процесі виявлення уреаплазм у відсутності інших патогенів дозволяє вважати їх етіологічним чинником захворювання. Не розташовують до благодушності і наведені вище результати: U.urealiticum несподівано виявилася мікроорганізмом, максимально стійким до проведеної терапії. Багато дослідників вказують на взаємозв'язок присутності уреаплазм в цервікальному каналі вагітних з передчасним розривом амніотичної оболонки і вилиттям навколоплідних вод; профілактична антибіотикотерапія зменшувала як частоту виявлення уреаплазм, так і ризик передчасних пологів.
Таким чином, при виявленні потенційно патогенних бактерій і вірусів не слід забувати про те, що хвороба є взаємодія мікро-і макроорганізму. У багатьох випадках кількісні критерії виявляються непридатними: інфекційний процес може бути набагато небезпечнішим в присутності відносного невеликої кількості високопатогенних збудників, при активному синергізмі патогенів, при тимчасовому ослабленні імунної системи.
Все це дозволяє вважати, що навіть кількісна модифікація методу ПЛР може і повинна застосовуватися при встановленні етіологічних факторів захворювань урогенітальної сфери. Метод високо інформативний не тільки при первинній діагностиці інфікування урогенітального тракту, але і при контролі излеченности від ІПСШ. У поєднанні з іншими методами діагностики він дає мислячому лікаря повну інформацію для прийняття правильного рішення.
* Івашків Є.А. Місце якісної модифікації методу ПЛР в первинній діагностиці ІПСШ і контролі ефективності лікування. СБ тез. докл. 3-й Всеросійський науково-практичної конференції "генодіагностікі в сучасній медицині, Москва, 25-27 січня 2000 р.". М., 2000. с. 102-106.
При публікації будь-яких фактів, викладених у статті, посилання на згадане вище видання обов'язкове. При публікації в Internet можлива посилання на цю сторінку з зазначенням авторів та назви статті.
Оригінальна версія статті.