Експертиза біологічно активних добавок та лікарських препаратів для зору. Визначення якісного та кількісного складу антоціанінових пігментів ..

д.х.н. Готтих М.Б., Ташлицької В.М.

НДІ фізико-хімічної біології імені О.М. Бєлозерського МДУ

Введення

антоцианозидів і флавоноїди, що містяться в листі і плодах чорниці (Vaccinium myrtillus), завдяки їх у ираженному антиоксидантній та сосудопротекторному дії, становлять для офтальмологів особливий інтерес [1].

За даними різних авторів, антоцианозидів чорниці сприяють поліпшенню реологічних властивостей крові, оскільки знижують тонус судинної стінки і сприяють її зміцненню (ефект обумовлений участю даних речовин у регуляції біосинтезу колагену), зменшують тромбоутворення, а також прискорюють регенерацію знебарвленого родопсину - світлочутливого пігменту сітківки. Прискорення регенерації родопсину і активація ферментів сітківки під впливом екстракту чорниці покращують нічний зір, знижують ризик розвитку дистрофії сітківки, прискорюють процес відновлення зору після тривалих зорових навантажень [2,8]. За рахунок позитивного впливу на синтез фосфоліпідів клітинних мембран, антоцианозидів чорниці зменшують крихкість капілярів, відновлюють їх прохідність при судинних розладах (тромбозах), що сприяє поліпшенню трофіки сітківки ока.

Крім того, антоцианозидів і флавоноїди чорниці пригнічують патологічну альдозо-редуктазну активність в тканинах кришталика і попереджають розвиток катаракти [3].

антоцианозидів є основними діючими на зір речовинами чорниці. Вони представляють із себе з'єднання антоцианінів з вуглеводами (глікозиди) [4] . Це стан забезпечує їх стійкість до світла і дії ферментів, а крім того - у формі глікозидів поліпшується розчинність пігментів у клітинному соку [5]. Глікозиди зі складу антоцианозидів не проходять через клітинну мембрану, тому основу фармакологічної активності екстрактів становлять саме антоцианіни [6]. Ефективність антоцианінів доведена в ряді досліджень [7].

В даний час у Росії зареєстровані кілька харчових добавок та лікарських препаратів офтальмологічного профілю, що містять екстракти чорниці. Оскільки користь препаратів з чорницею безпосередньо залежить від концентрації антоцианінів в них, нами була проведена експертиза біологічно активних добавок та лікарських препаратів для зору з метою визначення якісного та кількісного складу. Для аналізу ми використовували високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) і рН-диференціальну УФ-спектрофотометрію .

Мета дослідження: визначення кількісного і якісного змісту антоціанових пігментів чорниці в п'яти зразках наступних препаратів: «Фокус» (виробник АКВІОН, Росія), «Вітрум віжн форте» (виробник Unipharm Inc , США), «Чорниця-форте» (виробник Евалар, Росія), «Окуліст» (виробник ДІОД, Росія), «Стрікс» (виробник Ferrosan, Данія).

Матеріали і методи дослідження:

Для досліджень в аптеках і аптечних пунктах були закуплені п'ять зразків біологічно активних добавок для очей, до складу яких входить чорниця: « ; Вітрум віжн форте »,« Фокус »,« Стрікс »,« Окуліст »,« Чорниця-форте ».

У роботі дані зразки були зашифровані наступним чином:

Препарат № «Фокус» (АКВІОН, Росія) 1 "Вітрум віжн форте» (Unipharm Inc, США) 2 «Чорниця-форте» (Евалар, Росія) 3 «Окуліст» (ДІОД, Росія) 4 «Стрікс» (Ferrosan, Данія) 5 Підготовка зразків для дослідження:

Антоцианіни із зразків екстрагували дистильованою водою з розрахунку вмісту антоцианінів 0,05-0,2 мг/мл [9]. Для цього таблетка або вміст капсули ретельно подрібнювались в агатовій ступці. Для екстракції відповідна навішення порошку кожного зразка містилася в пластикову пробірку об'ємом 50 мл і додавався розрахований обсяг дистильованої води (від 10 до 50 мл залежно від навішування і зразка) для отримання розчинів з концентрацією 2,0; 4,0; 5,0; 2,0 і 2,0 мг/мл для зразків 1-5 відповідно. Для ВЕРХ дослідження були приготовлені розчини з більшою концентрацією - 20,0 мг/мл; 40,0; 50,0; 20,0 і 20,0 мг/мл для зразків 1-5 відповідно. Екстракція проводилася при безперервному перемішуванні на термошейкер C24KC Refrigerated incubator shaker Edison, NJ, USA , при 160 об./хв, температурі 37 оС протягом 30 хв. З отриманих розчинів відбиралися аліквотах об'ємом 1 мл, які центрифугували 10 хв при 14 000 об./хв, фільтрували через Millex-GV13, 0,22 um, 13 mm Filter Unit, MILLIPORE і зберігали при -10 оС.

Визначення сумарного вмісту антоціанінових пігментів методом рН-диференціальної спектрофотометрії.

Для методу рН-диференціальної спектрофотометрії були використані буферні розчини № 1 і № 2:

Розчин № 1: рН 1 - 4,05 мг КСl, 1,238 мл конц. НСl в 100 мл води.

Розчин № 2: рН 4,5 - 1,64 г натрію ацетату в 100 мл води і НС l до рН 4,5.

До 0,96 мл буферного розчину № 1 або № 2 додавали 40 мкл екстракту, приготованого як описано вище, і визначали оптичну щільність при 510 нм і 700 нм з відповідним буфером як розчин порівняння. Використовували УФ-спектрофотометр Cary 50bio виробництва Varian (США). Для кожного зразка експеримент проводили двічі.

Сумарний вміст антоціанінових пігментів розраховували за формулою [7]:

С (?антоціанін, мас.%) = 100% ? [(А510рН1-А700рН1) - (А510 рН4, 5 - А700рН4, 5) ] ? MW ? F/(? ? l ? C),

де:

? і MW & ndash ; коефіцієнти молярного поглинання і молекулярна маса антоцианіни, використовуваного в якості стандарту (для ціанідин-3-глюкозиду 26 900 і 449,2 відповідно);

F = 25 - коефіцієнт розведення; l = 1 - довжина оптичного шляху кювети, см; C - концентрація приготовленого розчину зразка, г/л.

Визначення якісного складу антоціанінових пігментів методом ВЕРХ

Якісний склад антоціанінових пігментів визначався методом обращеннофазной ВЕРХ на колонці Gemini C18 (2) 4,6 ? 150 mm (5um) виробництва Phenomenex (США).


Використовувалося градієнтне елюювання з рухомою фазою А (0,151% розчин трифторуксусной кислоти у воді) і рухомою фазою В (0,151% розчин трифторуксусной кислоти в ацетонітрилі) за програмою 5-40% В за 11 хв при швидкості потоку 1,5 мл/хв, температурі 25 ° С, з УФ-детекцією при 520 нм і УФ-спектральними даними від 230 до 800 нм. Був використаний хроматограф Agilent 1100, що складається з чотириканального градієнтного насоса з дегазатор, автосамплера, термостата і діод-матричного детектора. Збір та обробка хроматограм здійснювалася за допомогою програм « ChemStation B .01.03» і « ACD/SpecManager 12.01».

Для ВЕРХ-аналізу зразків № 1, 4, 5 з концентрацією 20 мг/мл використовувалася аліквотах 1 мкл, а для зразків № 2, 3 з концентрацією 40 і 50 мг/мл - аліквотах 10 мкл.

Результати дослідження та їх обговорення

За допомогою УФ-спектрометричного аналізу було досліджено сумарний вміст антоціанінових пігментів у всіх зразках. Отримані дані наведено на рис. 1 і в таблиці 1.

Рис. 1. Приклади спектрів поглинання розчинів зразків при рН 1.0 (А) і 4,5 (Б), де 0 - базова лінія, 1-5 - зразки № 1-5

Таблиця 1. Розрахунок середнього вмісту суми антоціанінових пігментів у зразках № 1-5 методом рН-диференціальної спектрофотометрії

№ зразка C зразка, г/л А510 рН 1 А700 рН 1 А510 рН 4,5 А700 рН 4,5 Сумарна концентрація антоціанінових пігментів,% Маса капсули (таблетки), г Маса порожній капсули

Маса суми антоціанінових пігментів у капсулі (таблетці), мг

Заявлена ??маса антоціанів, мг 1 2 0,2606 0,0046 0,0587 0,0051 4,225 0,382 0,0958 12,09 ± 0,97 12,5 2 4 0,0038 0 0,0031 0,0006 0,014 0,833 0 0,11 ± ; 0,009 - 3 5 0,022 -0,0002 0,0025 0,0004 0,168 0,2545 0 0,43 ± 0,034 - 4 2 0,0912 0,0001 0,0129 0,0011 1,655 0,3819 0,0731 5,11 ± 0,41 10 5 2 0,1035 -0,0001 0,0103 0,0009 1,966 0,459 0 9,03 ± 0,72 -

Як видно з отриманих даних, всі аналізовані зразки містять антоціаніновие пігменти, однак їх концентрація в різних зразках варіюється в широкому діапазоні від 0,01 до 4,2%, а вміст в одній таблетці або капсулі від 0,1 мг до 12,1 мг.

Для визначення якісного складу зразків використовувався метод обращеннофазной ВЕРХ. Отримані результати наведені на рис. 2. Віднесення піків проводилося на підставі часів утримування і співвідношення площ. Часи утримування і відповідні площі піків наведені в таблиці 2. Як видно з хроматограм і таблиці 2, якісний склад і співвідношення компонентів всіх досліджених зразків, крім зразка № 2, практично однакові (в межах похибки методу визначення площі погано дозволених піків) і відповідають літературними даними для екстрактів чорниці [7]. Хроматографічний профіль зразка № 2 не відповідає антоціаніновим пигментам чорниці і, очевидно, має інше джерело.

Рис. 2. Приклади хроматограм екстрактів зразків № 1-5, отримані градієнтним методом оф-ВЕРХ з детекцией при 520 нм

Таблиця 2. Середні часи утримування і площі хроматографічних піків, отриманих при ВЕРХ-аналізі зразків № 1-5

№ піку Ім'я компоненту

Час утримування, хв

Площа піку при 520 нм, мВ * сек

№ 1 v = 1 мкл C = 20 г/л № 2 v = 10 мкл C = 40 г/л

№ 3

v = 10 мкл C = 50 г/л № 4 v = 1 мкл C = 20 г/л № 5 v = 1 мкл C = 20 г/л 1 Delphinidin 3-Glucoside 4,637 291 220 71 196 2 Delphinidin 3-Galactoside 4,81 341 205 68 207 3 Cyanidin

3-Galactoside + Delphinidin 3-Arabinoside

5,123 481 375 120 357 квітні Cyanidin 3-Glucoside 5,29 436302 89264 5 Cyanidin 3-Arabinoside 5,45 207140 47114 6 Petunidin 3-Galactoside 5,623 200 130 49 162 7 Petunidin 3-Glucoside 5,79 102 73 22 49 8 Peonidin 3-Glucoside 5,95 203 163 55 97 9 Malvidin 3-Glucoside 6,057 151 129 55 87

v - обсяг аліквотах розчину зразка, використаної для аналізу;

C - концентрація розчину зразка. Висновки

На підставі отриманих даних (якісний аналіз методом оф-ВЕРХ) можна стверджувати, що всі досліджені зразки препаратів, крім " Вітрум віжн форте »(Unipharm Inc , США) , дійсно містять антоціаніновие пігменти з екстрактів чорниці, а не з інших природних джерел. Препарат «Вітрум віжн форте» ( UnipharmInc , США) містить невелику кількість антоціанінових пігментів з іншого джерела. Крім того, кількісний вміст цих сполук, визначений методом рН-диференціальної спектрофотометрії, варіюється в широкому діапазоні. У досліджених нами харчових добавках і лікарських препаратах офтальмологічного профілю є антоціаніновие пігменти з екстрактів чорниці (та іншого джерела) в такій кількості (препарати розташовані в порядку убування):

Препарат

Зміст антоцианів чорниці в таблетці (капсулі), мг

«Фокус» (АКВІОН, Росія) 12,09 «Стрікс» (Ferrosan, Данія) 9,03 «Окуліст» (ДІОД, Росія) 5, 11 «Чорниця-форте» (Евалар, Росія) 0,43 "Вітрум віжн форте» (Unipharm Inc, США) 0,11 Література 1. Ставицька , Т.В. Застосування екстракту чорниці в офтальмології/Клінічна офтальмологія .- 2002. - Т. 3. - № 2. - С. 86-88.

2. Nakaishi H., Matsumoto H., Tominaga S., Hirayama M. Altern Med Rev 2000; 5 (6): 553-562.

3. Bravetti G., Ann Ottalmol Clin Ocul, 1989, 115, p. 109-111.

4. ; Муравйова Д.А., Самилін І.А., Яковлєв Г.П. Фармакогнозія: Підручник. - 4-е вид., Перераб. і доп. - М.: Медицина, 2002. - 656 с.

5. Schmitt E., Stopper H. Nutrition and cancer 2001; 41 (1 & 2): 145-149.

6. ; Camire M. Bilberries and Blueberries as Functional Foods and Nutraceuticals./Lancaster, Pa: Technomic Publishing Co Inc; 2000.

7. Єгоров О.А., Романенко І.А. Сучасні аспекти патогенезу, діагностики, клініки і лікування вікової макулярної дегенерації. - Офтальмологія. - № 1. - 2009.

8. Head KA Altern Med Rev 2001; 2: 141-166.

9. ; Керівництво по методах контролю якості та безпеки біологічно активних добавок до їжі. Мінохоронздоров'я Росії. - Москва, 2004. - С. 106.

//