Застосування стовбурових клітин і фібробластів у клініці естетичної медицини - Стовбурові клітини.

Культивування і трансплантація клітин і тканин фібробластів - область біомедицини, що має початок понад століття тому, але що отримала своє справжнє розвиток в останні 30-40 років, коли з'явилися методики, що зумовили можливість культивування окремих клітин. Сьогодні значна кількість клітин, з 200 складових людський організм, успішно розмножуються in vitro. У їх число входять і фібробласти.
Наслідком розвитку і вдосконалення клітинної біології стало формування нового напрямку клітинної та тканинної інженерії, що відноситься до біомедичної технології, заснованої на використанні культивованих клітин людини. Завдання цього напрямку - забезпечення заміщення, відновлення пошкоджених тканин за рахунок імплантації або трансплантації вирощених in vitro клітин зі здорових тканин і органів. Можливість культивування в достатньому обсязі необхідних для практики фібробластів робить реальним їх використання в клініці. У Росії цей напрям отримав розвиток у ряді наукових і практичних установ: Інститут цитології РАН, Військово-медична академія МО РФ, Інститут хірургії ім. А.В. Вишневського РАМН, Інститут кардіології МОЗ РФ, НДІ трансплантології і штучних органів, Інститут Клітинних Технологій та ін
Фібробласти - основні клітини сполучної тканини. Ці клітини мають мезенхімального походження і морфологічно характеризуються як клітини круглої або подовженої, веретеноподібної плоскої форми з відростками і плоским овальним ядром. Фібробласти синтезують тропоколагену, попередник колагену, міжклітинний матрикс і основна речовина сполучної тканини, аморфне желе подібна речовина, що заповнює простір між клітинами і волокнами сполучної тканини. Беруть участь у загоєнні ран. У результаті диференціювання фібробласти перетворюються в менш активні зрілі клітини - фіброціти.
Близько 100 років тому у зв'язку з розвитком методів підтримки клітин in vitro з усією гостротою постало питання про те, обмежений чи потенціал клітин багатоклітинного організму. A. Каррель культивував фібробласти серця курячих ембріонів в культурі протягом 34 років, при цьому клітини пройшли тисячі ділень без змін їх морфологічної будови або швидкості росту. Ці досліди зустріли серйозні заперечення. Зокрема, вказувалося, що недосконалість методів культивування приводило до внесення свіжих клітин в культури при кожному їх пересіванні. З іншого боку, онкологам добре відомі численні штами перещеплюваних in vivo і in vitro пухлинних штамів і ліній, які підтримуються протягом багатьох років, іноді десятків років, клітини яких є практично безсмертними (імморталізірованнимі). Поряд з цими дослідами, з'явилися спостереження про те, що в клітинних культурах все ж не вдається довго підтримувати клітини, отримані з нормальних, не пухлинних тканин.
У 1961 р. L. Hayflick і PSMoorhead представили дані про те , що навіть в ідеальних умовах культивування фібробласти ембріона людини здатні ділитися лише певну кількість разів (50 +/-10). Було встановлено, що при самому ретельному дотриманні всіх заходів безпеки при пересіву клітини проходять in vitro ряд цілком морфологічно помітних стадій (фаз), після чого їх здатність до проліферації вичерпується і в такому стані здатні знаходитися досить тривалий час. У повторних дослідах це спостереження було багаторазово відтворений, остання фаза життя клітин в культурі була уподібнене клітинному старіння, а сам феномен отримав по імені автора назва ліміту Гейфліка. Більше того, виявилося, що зі збільшенням віку донора число поділок, які були здатні зробити клітини організму, істотно зменшувалася, що призвело до уявлення про існування гіпотетичного лічильника поділів, що обмежує загальне їх число.
Після встановлення ліміту Гейфліка і фактів, що нормальні фібробласти в культурі зберігають диплоїдний каріотип і мають низьку експресію антигенів гістосумісності і відсутність онкогенних потенцій, стало можливе використання культивованих поза організмом фібробластів людини для терапевтичних цілей. Наукові дослідження та клінічні розробки в даному напрямку протікають дуже інтенсивно, що пов'язане із загальним підйомом клітинних технологій на основі стовбурових клітин.
Спроби використовувати культивовані поза організмом фібробласти для терапевтичних цілей почали вживатися незабаром після встановлення фактів, що нормальні фібробласти в культурі зберігають диплоїдний каріотип і мають обмежену тривалість життя, низьку експресію антигенів гістосумісності, відсутність онкогенних потенцій. Було показано, що пересаджені алогенних фібробласти безпосередньо впливають на загоєння ран (Ross, 1968) і на епітелізацію (Coulomb et el, 1989). З'явилися дані, що фібробласти можуть продукувати колаген I і II типів (Varga et al., 1987) і компоненти позаклітинного матриксу: ламінін, нідогени, тінасцін, хондроїтин-4-сульфат, протеоглікани (Halfter et al., 1990), фібронектину (Matsura , Hakamori, 1985), деякі фактори росту, а також інші речовини.
В даний час є значна кількість робіт, що свідчать про велику роль факторів росту у епітелізації шкіри. Фактори зростання - це регуляторні пептиди (тканинні гормони), що виробляються клітинами різних типів, які в значній мірі прискорюють регенераторний процес. Багато факторів зростання продукуються фібробластами:
1. Основний фактор росту фібробластів (bFGF) позитивно впливає на зростання всіх типів клітин шкіри, стимулює продукцію компонентів позаклітинного матриксу фібробластами (фібронектину та колагену), стимулює хемотаксис фібробластів і вироблення ними нових волокон колагену, еластину і фібронектину;
2. Трансформуючий ростової фактор (TGF-бета) стимулює хемотаксис фібробластів і продукцію ними колагену і фібронектину (Капе С. et al., 1991).
3. Трансформуючий ростової фактор (TGF-альфа) впливає на ангіогенез (Chen J., et al., 1993). Віднайдені фібробластами чинники зростання можуть прискорювати відновлення ураженої дерми, що багато в чому пояснює стимулюючий вплив алогенних клітин на загоєння ран.
4. Епідермальний фактор росту (EGF)-посилює проліферацію та міграцію кератиноцитів;
5. Фактор росту кератиноцитів (KGF)-посилює загоєння і епітелізацію ран;
6. Трансформуючий фактор росту (a-NGF) активно впливає на ангіогенез.
Крім того, фібробласти продукують компоненти позаклітинного матриксу: нідогени, ламінін, тінасцін, хондроїтин-4-сульфат, протеоглікани.
В Інституті хірургії ім. А. В. Вишневського РАМН розроблений і впроваджений у клінічну практику новий метод лікування великих опікових ран, принципово відрізняється від раніше запропонованих, заснований на використанні культури алогенних фібробластів (Д. С. Саркісов, В. П. Туманов із співавт., 1990; . Д. Федоров, Д. С. Саркісов з співавт., 1993; Д. С. Саркісов, А. А. Алексєєв із співавт., 1994). Передумовою до його розробки стали передували фундаментальні дослідження регенераторного процесу, що показали ключову роль у ньому фібробластів (В. В. Сєров, А. Б. Шехтер, 1982; Є. А. Єфімов 1984; Л. І. Бобро 1990; B. Coulomb, L. Dubertret et. al., 1984; B. Coulomb, P. Satag, et al. 1986), а також встановили факт часткової втрати фібробластами поверхневих антигенів гістосумісності у процесі культивування (P. Хей 1989; J. Nanchahal, et al. 1989).
Патогенетичний механізм дії запропонованого методу полягає в синтезі алогенними фібробластами екстрацелюлярного матриксу, факторів росту, стимуляції проліферації власного епітелію, спрямованих на відновлення як епідермального, так і дермального компонента шкіри. При опіках 3А ступеня і загоюються трансплантацію 3-х денний культури аллофібробластов здійснюють безпосередньо на підготовлені в результаті комплексного лікування рани. При глибоких опіках 3B, 4 ступеня трансплантацію аллофібробластов поєднують з аутодермопластики з коефіцієнтом розширення 1:6 і більше. В останньому випадку аллофібробласти стимулюють епітелізацію осередків аутотрансплантата.
Накопичений клінічний досвід у різних опікових центрах і відділеннях (А. А. Алексєєв, А. Ю. Яшин 1996; А. А. Алексєєв, Д. А. Саркісов з співавт., 1997; С. І. Воздвиженський, Л. І. Будкевич з співавт., 1996; Матчина Є.М., Потапов В.Л., Огольцова В.А. 1996; Д. Я. Алейник, В.А . Аминев з співавт. 1998; Н. М. Кузнєцов, О. М. мазка із співавт. 1998), показав його високу ефективність. Перевагами методу є - невеликі терміни культивування аллофібробластамі (3 доби), хороше приживлення трансплантатів (в середньому 97%), можливість створення банку алогенних клітин, відносно невелика собівартість.



У дитячому опіковому центрі при ДГКБ № 9 (А. К. штукатурів ; А. О. Бахарєв, Г. З. Сайдгалін Н. А. Шмельова) щорічно проходить лікування 370-420 дітей, постраждалих від опіків. З них у 130-150 дітей визначаються глибокі і поширені опіки, у 35-40% яких для прискорення епітелізації можливе застосування клітинних культур. Загальна площа глибокого ураження, що вимагає оперативного лікування, у них становить до 35-40 тисяч кв. см на рік. При прийнятою методикою передопераційної трансплантації аллофібробластов, у співвідношенні 30-60 тис. клітин на см2 ураженої шкіри, потреба в культурі фібробластів складе 1,2-2 млрд. клітин на рік. При успішній розробці методу з використанням епітеліальних клітинних пластів їх потреба може скласти до 45-50 тис. кв. см на рік.
Аллофібробласти вирощувалися в лабораторії клітинних культур ЕНІІВІ. Проліковано 27 хворих з термічними ураженнями 3-4 ступеня загальною площею поразки від 4 до 56%. Застосування культури аллофібробластов для передопераційної трансплантації на рану з метою прискорення епітелізації рани у хворих з глибокими опіками виявилося виправданим. Культура аллофібробластов застосовувалася або у вигляді суспензії, або на підкладці на основі биосинтетического покриття "Фолідерм".
Показаннями до використання методу для лікування глибоких опіків у дітей є наявність опіків ЗА, 3В, і 4 ступеня понад 10% площі тіла, дефіцит донорських ресурсів, довго незагойні гранулирующие рани. Абсолютних протипоказань до використання методу немає. Відносними протипоказаннями є: загальні вкрай важкий стан хворого, недостатньо підготовлена ??рана із обсемененностью рани більше 100 000 мікробних тіл на 1 гр. тканини, наявність грибкової флори.
сполучної тканини. Імунофлуоресцентний світлова мікроскопія показує фібробласти шкіри ембріона людини: клітинні ядра (сині), цитоплазма (червона) - фібронектину, мережа колагенових волокон (зелена).
Результати впровадження методу в ДГКБ № 9 показали високу ефективність і економічну доцільність впровадження даної технології для лікування тяжких хворих з термічними травмами.
Останнім часом стали накопичуватися дані про застосування культивованих in vitro фібробластів у стоматології. Про позитивний ефект лікування пародонтиту з використанням культури аллофібробластов, отриманої з дерми плодів людини, нещодавно заявили вітчизняні дослідники (В. П. Туманов із співавт., 1998 р.). Даними авторами був розроблений новий спосіб лікування запально-деструктивної форми пародонтиту з використанням культури аллофібробластов людини, заселених на тверду мозкову оболонку.
У своїй дисертаційній роботі "Використання культивованих аллофібробластов в комплексному лікуванні захворювань пародонту" Г.С. Рунова на підставі отриманих експериментальних даних переконливо показала ефективність розробленого оригінального методу лікування хронічного пародонтиту при використанні культивованих аллофібробластов і твердої мозкової оболонки.
Перевага даного способу лікування пародонтиту полягає в тому, що в раневом ложі при імплантації ТМО та аллофібробластов не відбувається так званого процесу біодеградації плодового матеріалу і культивованих аллофібробластов, а імплантант вбудовується в кістковий дефект і трансформується в подальшому в грубоволокнисту кісткову тканину альвеолярних відростків. Культивовані аллофібробласти постійно виділяють основний фактор росту (FGF), формують екстрацелюлярний матрикс, фібронектину і інші речовини, які сприяють активації процесів ангіогенезу і подальшого остеогенезу.
Останнім часом з'явилися повідомлення про можливість застосування фетальних фібробластів для відновної терапії в косметології.
У ембріогенезі людини і ссавців утворення декількох сотень варіантів спеціалізованих клітин відбувається з пулу зародкових листків (ектодерми, ентодерми і мезодерми), а також мезенхіми. Мезенхіма - це клітинна мережа пухкої сполучної тканини, що виконує численні метаболічні, сигнальні, механічні (опорні) та морфогенетичні функції.
Фібробласти є основним клітинним елементом середнього шару шкіри, званого дермою. Крім фібробластів, дерма містить деякі інші типи клітин, а також колаген, еластин і глікозаміноглікани (міжклітинну речовину), кровоносні судини і залози (потові і сальні) Основна функція фібробластів - синтезувати і ресоздавать міжклітинну речовину. Фібробласти синтезують і виділяють у навколишнє середовище велику кількість біологічно активних речовин, серед яких можна виділити різні фактори росту, компоненти позаклітинного матриксу і ферменти, за допомогою яких вони руйнують колаген і гіалуронову кислоту, а також синтезують ці молекули заново. Цей процес відбувається безперервно, і завдяки йому міжклітинну речовину постійно оновлюється. Особливо інтенсивно протікає метаболізм гіалуронової кислоти.
Як і у всіх органах і тканинах людського організму, в шкірі відбуваються вікові зміни протягом життя. Однією з основних причин старіння шкіри є зниження проліферативної і синтетичної активності фібробластів. Особливо швидко втрачається здатність до синтезу міжклітинної речовини. У той же час катаболические функції довгий час залишаються на колишньому рівні. Тому в старіючої шкірі зменшується товщина дерми, вміст вологи в ній падає, в результаті шкіра втрачає пружність і еластичність. Наслідком цього є розтягнення шкіри і утворення зморшок.
Старіння шкіри на різних ділянках тіла протікає нерівномірно. Особливо швидко старіють відкриті ділянки шкіри і шкіра в місцях згинів. У той же час на закритих областях вікові зміни шкіри менш виражені.
У клініці лікувальної косметології «Версаль» (м. Єкатеринбург) проведено дослідження ефективності препарату фетальних легеневих фібробластів, що випускається Єкатеринбурзький НДІ вірусних інфекцій під назвою «Культура диплоїдних клітин людини для замісної терапії ». Кількість пролікованих пацієнтів склало 61 осіб, в т.ч. 43 жінки і 16 чоловіків. Вік пацієнтів - від 21 до 62 років. Використані такі способи введення препарату:
- Аплікація на шкіру чистого препарату;
- Аплікація на рану чистого препарату під пов'язку;
- Аплікація препарату на шкіру під маски і креми;
- Нанесення препарату, попереднього змішаного з масками та кремами;
- Введення препарату в шкіру за допомогою ультразвуку, іонофорезу, електрофорезу;
- внутрітканинне ін'єкції препарату (внутрішньошкірні, підшкірні, в тканину рубця).
Препарат клітин використовувався для лікування вугрової хвороби, вікових змін шкіри, включаючи зморшки шкіри обличчя, рубцевих змін шкіри, а також алопеції та гніздовий плішивості. Проведені дослідження препарату підтвердили високу ефективність його застосування в косметології при лікуванні широкого спектру захворювань. Не було виявлено жодного випадку ускладнень, пов'язаного з використанням культури фібробластів. За результатами дослідження препарат рекомендується для широкого застосування в косметологічній практиці.
Наведені дані свідчать про великі можливості відновлювальної терапії за допомогою фетальних фібробластів. На нашу думку, необхідно розширювати спектр препаратів на основі фетальних фібробластів. Клітинна терапія грунтується на принципі, що хворий або старіючий орган повинен лікуватися або стимулюватися матеріалом, отриманим з подібного органу.
У зарубіжній практиці першими зареєстрованими і дозволеними до клінічного застосування комерційними тканеінженернимі продуктами стали конструкції для відновлення шкірних дефектів, такі як Dermagraft (Smith & Nephew), TestSkin II (Organogenesis), Apligraf (Organogenesis), AlloDerm (Life-Cell) [10,12,13]. В даний час, пересадка цих матеріалів була проведена вже сотням тисяч пацієнтів з хронічними виразками і опіками. Однак, існувала думка, що культивування in vitro і фабрикація конструкту може структурно і/або функціонально змінити ДНК або викликати експресію, не характерних для вихідної клітини генів, наприклад онкогенів.